大球蓋菇菌種生產方法和蘑菇、草菇菌種生產方法基本相同，可用組織分離法和孢子分離法獲得純菌種，新區主要靠引進母種或原種。適合大球蓋菇母種生產的培養基如下：
一、母種培養基
1、麥芽糖酵母瓊脂培養基(MYA)大豆蛋白胨(豆胨)1克、酵母2克、麥芽糖20克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
2、馬鈴薯葡萄糖酵母瓊脂培養基(PDYA)馬鈴薯300克(加水1500毫升，煮20分鐘，用濾汁)、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
3、燕麥粉麥芽糖酵母瓊脂培養基(DMYA)燕麥粉80克、麥芽糖10克、酵母2克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
上述3種配方中如不加瓊脂，即可作為液體培養基。以上培養基需按常規配制、分裝、滅菌、接種和培養。
二、原種和栽培種培養基
1、小麥稈或裸麥稈，切碎(長2―3厘米)，泡濕，裝瓶，高壓滅菌后備用。
2、小麥、裸麥，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至沒有白芯但表皮不破，加2%碳酸鈣，裝瓶，高壓滅菌后備用。
3、木屑和小木片各40%、麩皮20%，制作栽培種培養基。
還可用平菇或金針菇下腳料作培養基重新滅菌后備用。
三、接種
可以用培養3―4天的液體菌種接種。若用固體菌種必須加大接種量(菌種/培養料)，接種量最少10%，最好15%―20%。
四、培養
接種后，把菌種瓶或袋放在20―28℃培養室中培養。大球蓋菇菌絲生長幾天后，菌絲生長速度會逐漸緩慢，加速菌絲生長的方法是攪拌。用液體菌種接種的無菌麥粒培養基，每隔3―7天搖瓶一次，把菌絲搖斷，可以刺激菌絲再生，能保證菌絲生長旺盛。
一、母種培養基
1、麥芽糖酵母瓊脂培養基(MYA)大豆蛋白胨(豆胨)1克、酵母2克、麥芽糖20克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
2、馬鈴薯葡萄糖酵母瓊脂培養基(PDYA)馬鈴薯300克(加水1500毫升，煮20分鐘，用濾汁)、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
3、燕麥粉麥芽糖酵母瓊脂培養基(DMYA)燕麥粉80克、麥芽糖10克、酵母2克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
上述3種配方中如不加瓊脂，即可作為液體培養基。以上培養基需按常規配制、分裝、滅菌、接種和培養。
二、原種和栽培種培養基
1、小麥稈或裸麥稈，切碎(長2―3厘米)，泡濕，裝瓶，高壓滅菌后備用。
2、小麥、裸麥，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至沒有白芯但表皮不破，加2%碳酸鈣，裝瓶，高壓滅菌后備用。
3、木屑和小木片各40%、麩皮20%，制作栽培種培養基。
還可用平菇或金針菇下腳料作培養基重新滅菌后備用。
三、接種
可以用培養3―4天的液體菌種接種。若用固體菌種必須加大接種量(菌種/培養料)，接種量最少10%，最好15%―20%。
四、培養
接種后，把菌種瓶或袋放在20―28℃培養室中培養。大球蓋菇菌絲生長幾天后，菌絲生長速度會逐漸緩慢，加速菌絲生長的方法是攪拌。用液體菌種接種的無菌麥粒培養基，每隔3―7天搖瓶一次，把菌絲搖斷，可以刺激菌絲再生，能保證菌絲生長旺盛。
